Maxamova-Gilbertova metóda sekvenovania DNA je metóda sekvenovania DNA vyvinutá Allanom Maxamom a Walterom Gilbertom v rokoch 1976-1977. Táto metóda je založen na čiastočnej chemickej modifikácii DNA v závislosti na prítomnej nukleobáze a následnom štiepení DNA reťazca na miestach hneď vedľa modifikovaných nukleotidov.^[1]

Maxam-Gilbertovo sekvenovanie bola prvá rozšírená metóda sekvenovania DNA a spolu so Sangerovou dideoxy metódou reprezentuje prvú generáciu metód sekvenovania DNA. Maxam-Gilbertovo sekvenovanie sa už bežne nepoužíva a bolo nahradené metódami sekvenovania novej generácie.

História

Príklad Maxam-Gilbertovho sekvenovania. Rovnako označené segmenty DNA sa štiepia na rôznych miestach, čím vznikajú fragmenty s rôznymi dĺžkami. Tieto fragmenty možno elektroforeticky separovať. Podľa dĺžky fragmentu je potom možné zistiť polohu štiepenej báze.

I keď Maxam a Gilbert publikovali ich metódu chemického sekvenovania dva roky po tom, čo Frederick Sanger a Alan Coulson publikovali svoju prácu ohľadne "plus-mínus" sekvenovania,^[2][3] Maxam-Gilbertovo sekvenovanie sa rýchlo stalo veľmi populárne, keďže purifikovaná DNA mohla byť použitá priamo, zatiaľ čo počiatočná Sangerova metóda vyžadovala klonovanie každého počiatku čítania na produkciu jednoreťazcovej DNA (ssDNA). S vylepšením metód, pri ktorých dochádza k ukončeniu reťazca (pozri nižšie) však použitie Maxam-Gilbertovho sekvenovania upadlo kvôli technickej náročnosti, ktorá bránila jeho použitiu v molekulárne biologických sadách (kitoch), použitiu nebezpečných chemikálií a problémom pri zmene veľkosti (pri dlhších reťazcoch).^[4]

Článok "A new method for sequencing DNA" (Nová metóda sekvenovania DNA), ktorý vydali Allan Maxam a Walter Gilbert v roku 1977, bol ocenený Divíziou histórie chémie Americkej chemickej spoločnosti. Cena bola odovzdaná Katedre molekulárnej a bunkovej biológie Harvardovej univerzity.^[5]

Proces

Maxam-Gilbertovo sekvenovanie vyžaduje rádioaktívne značenie na jednom 5' konci DNA fragmentu, ktorý sa má sekvenovať (typicky sa využíva kinázová reakcia s použitím gamma-³²P ATP). DNA je potom rozdelená do 4 reakčných nádob na štyri reakcie. Pôsobenie chemikálií následne vytvorí štepy u jedného alebo dvoch zo štyroch nukleotidov v každej zo štyroch reakcií (A+G, G, C+T, C). Puríny (A+G) sú depurinované pôsobením kyseliny mravčej, guaníny (a do istej miery adeníny) sú metylované dimetylsulfátom a pyrimidíny (C+T) sú hydrolyzované pôsobením hydrazínu. Pridaním soli (chloridu sodného) k hydrazínovej reakcii sa inhibuje reakcis s tymínom, reaguje teda len cytozín. Modifikovaná DNA sa potom môže štiepiť horúcim piperidínom v pozícii modifikovanej bázy. Koncentrácia chemikálií je regulovaná tak, aby vznikla v priemere jedna modifikácia na reťazec. Takto vznikne sada označených fragmentov, od rádioaktívne značeného konca po prvý štep v každej molekule.

Fragmenty vznikajúce v týchto štyroch reakciách sú potom analyzované elektroforézou na denaturujúcom akrylamidovom géli, čím sa určí ich dĺžka. Na ich vizualizáciu sa používa autorádiografia (ktorá zaznamenáva rádioaktívny ³²P), čím sa získa sada tmavších pásov, ktoré ukazujú polohu identických rádioznačených DNA molekúl. Sekvenciu je možné určiť podľa prítomnosti či neprítomnosti konkrétnych fragmentov.^[1][6]

Príbuzné metódy

Táto metóda viedla k vývoju metylačného interferferenčného stanovenia (Methylation Interference Assay), pomocou ktorého sa mapujú DNA-viažuce miesta v DNA-viažucich proteínoch.^[7]

Automatizované Maxam-Gilbertovo sekvenovanie bolo vyvinutú v roku 1994.^[8]

Referencie

Zdroj

Tento článok je čiastočný alebo úplný preklad článku Maxam–Gilbert sequencing na anglickej Wikipédii.

Chemický portál